增加PCR的特异性： 1. primers design 这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件 a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量 b. GC% 40%~~~~60% c. 5端和中间序列要多GC,以增加稳定性 d. 避免3端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GC e. 避免3端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3端的错配 g. 避免内部形成二级结构 h. 附加序列(RT site, Promoter sequence)加到5端, 在算Tm值时不算,但在检测互补和二级结构是要加上它们 i. 使用兼并引物时, 要参考密码子使用表,注意生物的偏好性,不要在3端使用兼并引物,并使用&nb
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