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）细菌的收获和裂解１．收获１）用Ｓorvall ＧＳ3转头（或与其相当的转头）于4℃以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。２）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的ＳＴＥ中。STE0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)２）按步骤１）所述方法离心，以收集细菌细胞。２．煮沸裂解法该法[根据Ｈolmes和Ｑuigley(1981)的方法修订而成] 可与随后的纯化步骤如氯化钯－溴化乙锭梯度平衡离心等步骤联合使用。建议该法只用于经氯霉素处理的培养物，未处理的培养裂解后过于粘稠，不利操作。当从大肠杆菌ＨＢ101或其衍生质粒（包括ＴＧ1）中大量提取质粒时，不宜采用煮沸法。这些细菌释放大量糖类，在氯化铯－溴化乙锭梯度中与闭环ＤＮＡ形成密度大致相同的区带。这些糖类还抑制以ＤＮＡ为模反或底物的酶。１）将500ml 培养物的细菌沉淀物[ 从上述步骤３）获得] 重悬于用冰预冷的10mlSTET中。STET0.1MOL/l nAcl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)5% Triton X-100将悬液移入50ml锥瓶中。２）加入1ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,沉吟于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。如溶液的pH值低于0.8溶菌酶不能有效地发挥作用。３）用一个夹子把锥瓶放在本生灯的明火上加热，直至液体恰好开始沸腾，不停地摇晃锥瓶。４）立即把瓶浸入装有沸水的大烧杯（2L）中，将瓶放在沸在水中，时间恰为4秒。５）将瓶浸入用冰预次序的水中５分钟，使之冷却。６）将粘稠状内容物从瓶中转移到超离心管（Beckman SW41或与其相当的管），于4℃以30 000转/分离心30分钟。原有的细菌增减物生长得越密，应越难将粘稠状裂解物转移到离心管中。如有绝对必要，可用长刀片和剪刀将裂解物剪成大小适于操作的大团块，或轴入10ml注射器的针筒中使之部分剪切。从经用氯霉素处理的细菌培养物中分离质粒ＤＮＡ时，一般不会出现这一问题。如细菌碎片未能形成紧密的团块，可以35 000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清转移到另一管内，弃去残存在管内的粘稠状液体。７）将上清转移到另一管内，纯化质粒ＤＮＡ ３，ＳＤＳ裂解法本法[根据Ｇodson和Ｖapnek(1973)的方法修订而成]的产量要低得多，是提取大质粒（大于15kb）的首选方法。１）将来自500ml培养物的细菌沉淀物[来自收获细菌的步骤３）] 洗过后重悬于10ml用冰预冷10%蔗糖、50mmol/L Tris.Cl(pH8.0)溶液中，将些悬液移至30ml的带盖螺口塑料试管[橡树岭（Oak Ridge)型]中。２）加2ml新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值小于8.0时，溶菌酶不能有效地发挥作用。３）加8ml 0.25mol/L EDTA(pH8.0), 将管倒置数次以混匀悬液， 在冰上放置10分钟。４）加4ml 10% ＳＤＳ，马上用一玻棒迅速混匀内容物，使ＳＤＳ均匀分散到整个细菌悬液中，操作应尽可能温和小心，以便最大限度地避免释放出来的ＤＮＡ受到剪切。５）立即加入6ml 5mol/L NaCl（终浓度为1mol/L）， 再次用玻棒温和地然而却是彻底地混匀内容物，在冰上放置至少１小时。６）于4℃用Beckman Ti50型转头（或与其相当的转头）以30 000转/分钟，去掉高分子量ＤＮＡ和细菌碎片。小心将上清转移到一个50ml的一次性塑料离心管中，弃去沉淀物。如果细菌碎片贴壁不紧，可用35 000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清转移到另一管中，去掉存在离心管内的粘稠状液体。７）上清用酚：氯仿和氯仿各抽提１次。８）将水相转移到－250nl的离心瓶中，于室温加入２倍体积的（约60ml ）乙醇，充分混匀，于室温放置1-2小时。９）于４℃下以5000g离心20分钟，回收核酸。10）充上清，于室温用70％乙醇洗涤沉淀物，按步骤９）离心，尽可能地去除乙醇，将离心管倒置于纸巾上，使最后残存的乙醇流干，在真空干燥内短时间干燥沉淀物，但不要使之完全干燥。11）用3mlTE(pH8.0)溶解ＤＮＡ。12）通过氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心纯化质粒ＤＮＡ。用聚乙二醇纯化质粒时，经过几次沉淀步骤，大质粒（大于15kb）容易产生切口，所以氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心法是纯化这种质粒的首选方法。４，碱裂解法 该法是Ｒ．Ｔreisman尚未发表的方法，同时也是Brinboim和Ｄoly(1979)及Ｉsh-Horowicz和Burke(1981)所用方法的改进。该方法对于目前使用的所有大肠菌菌株都卓有成效，并可与随后的纯化步骤，如骤乙二醇沉淀或氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心等，一并联合使用。注：括号中给出的体积可适用于未经氯霉素处理的培养。１）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物[ 来自收获细菌的步骤３）] 重悬于10ml（18ml）溶液Ｉ中。溶液Ｉ50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液Ｉ可成批配制，在10 lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于４℃。２）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液[10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)]。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。３）加20ml(40ml)新配制的溶液Ⅱ。溶液Ⅱ0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1％ＳＤＳ盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。４）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液Ⅲ。溶液Ⅲ5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml所配成的溶液对钾是３mol/L，对乙酸根是5mol/L。封住瓶口，摇动离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0℃放置后所形成的沉淀应包括染体ＤＮＡ、 高分子量ＲＮＡ和钾－ＳＤＳ－蛋白质－膜复合物。５）用ＳorvallＧＳ3转头（或与其相当的转头）于４℃以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟， 然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液Ⅲ与细菌裂解物混合不充分[步骤４）]。６）用４层干酪包布把上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。７）用Ｓorvall GS3转头（或与其相当的转头）于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于４℃离心，盐也会了生沉淀。８）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70％乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。９）用３ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。10）用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心或聚乙二醇沉淀。
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