转移电泳技术

％考马斯亮兰R－250－10％醋酸－45％甲醇。 11．氨基黑染色液在含10％醋酸的甲醇中加入氨基黑10B至饱和。 12．垂直板型及水平板型凝胶电泳槽 13．转移电泳槽 14．直流稳压电源0V~800V，0mA~100mA （三）操作方法 1．SDS—聚丙稀酰胺凝胶电泳（垂直板型）分离蛋白质。 ⑴凝胶的制备：丙烯酰胺 15.00g甲叉双丙烯酰胺 0.40g0.37Mol/L Tris—HCl（pH8.3） 50ml 此为丙烯酰胺母液，过滤后4℃保存备用。丙烯酰胺母液 8.30mlN、N、N、N—四甲基乙二胺（DEMED） 250ul10％SDS 0.25ml0.375Mol/L pH8.8 Tris－HCl 16.45ml 混合即为10％分离胶。丙烯酰胺母液 1.30mlTEMED 15.00ul10％SDS 0.10ml0.125Mol/L pH6.8Tris－HCl 8.60ml制成4％浓缩胶。将分离胶与浓缩胶真空抽气10min~15min，备用。 ⑵凝胶板的制备及加样：取1％的琼脂将凝胶膜底部的缝隙封固。在10％的分离胶中加入10％过硫酸铵0.25ml，混匀后，立即沿玻璃壁缓缓加入胶膜中，上端留出5cm的高度，然后用带有细针头的注射器轻轻地向胶面加入蒸馏水，静置数分钟，水胶界面消失，约20min～30min界面清晰（凝胶已聚合），用注射器将水吸出，并用滤纸吸干余水。在4％浓缩胶中加入10％过硫酸铵0.4ml，混匀后，沿玻璃壁缓慢倒入已聚合的分离胶的上面，立即插进样品槽模板。待凝胶聚合后（约20min～30min），轻轻拔出样品槽模板。将电泳缓冲液加入上、下电泳槽。将分离的蛋白质样品用0.01Mol/L Tris－HCl（pH8.0）－0.001Mol/L EDTA－1％SDS－5％硫基乙醇溶液作1︰1稀释，100℃加热处理3min之后，加入甘油10％及适当量溴酚兰，用微量注射器将样品注入样品槽中，蛋白质最后浓度一般为0.05mg／ml～1mg／ml。 ⑶电泳：上端接阴极，下端接阳极。电压120V、电流30mA，电泳时间5h~6h，待染料泳至距底部约1cm处时断电。 ⑷染色：切下一部分凝胶，用考马斯亮兰R－250染色作为对照。其余部分作转移电泳。
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