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性吸附。琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。 琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。 （三）试剂与配制 1．Sepharose 4B 2．CNBr（剧毒） 3．抗原或抗体 4．1Mol/L NaHCO3 取NaHCO3 84.01g加水至1 000ml。 5．0.1Mol/L NaHCO3 6．2Mol/L NaOH 7．0.01Mol/L pH7.4 PBS 0.2Mol/L Na2HPO4 38.0ml 0.2Mol/L Na2HPO4 162.0ml NaCl 32.76g 加水至4 000ml。 8．0.1Mol/L pH 2.8 甘氨酸即氨基乙酸—HCl缓冲液 甘氨酸15.01g加水至1 000ml，取此液，加0.2Mol/L HCl 84ml加水166ml共500ml。 9．7Mol/L尿素 10．0.2Mol/L NaHCO3,（含0.1Mol/L NaCI） 1Mol/L NaHCO3 100.00ml NaCl 2.93g 加水至500.00ml。 （四）实验方法 1．琼脂糖活化 ⑴ 取20ml Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，加少量的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液洗涤，立即转入100ml烧杯中，冰浴置于磁力搅拌器上。 ⑵ 在通风橱内称取2g溴化氰，加水20ml溶解，然后倒入琼脂糖中，小心滴加2Mol/L NaOH,使pH保持在11左右，反应10min。在1min~2min迅速调整pH为8.0～11.0维持10min。 ⑶ 将活化的琼脂糖迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以250ml冷的0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3抽洗。2．偶联蛋白 20ml 4B液体相当于一半的固相载体。⑴ 事先将需偶联的抗原（或抗体）蛋白200mg置于0.1Mol/L pH 9.0 NaHCO3液中透析数小时(一般偶联量为10~30mg/g载体)。⑵ 将活化的琼脂糖迅速倒入蛋白液中（在1.5min内，从抽洗到偶联），4℃缓慢搅拌过夜，使蛋白与活化的琼脂结合。3．装柱 ⑴ 选柱：不宜过大，一般以1.5×15cm的层析柱可装偶联蛋白的琼脂糖约30ml。 ⑵ 装柱：将已与蛋白偶联的琼脂糖装入层析柱内，拧紧下口夹，让其下沉，数分钟后松开下口夹，使溶液约以1ml/min的速度流出。 ⑶ 洗柱：以0.2Mol/L pH 9.0 NaHCO3（含0.1Mol/L NaCl）洗涤至洗出液的OD280＜0.02为止。收集全部的洗脱液，测得的OD280值×洗脱液的总ml数即为未偶联蛋白的含量，由此可计算偶联率。4．吸附与解吸附 ⑴按床体积1/10加样，浓度为1％～2%，缓慢加入待纯化的抗体（或抗原），用0.01Mol/L pH7.4PBS液洗脱，流速为1ml/min，至洗出液OD280＜0.02为止。 ⑵加0.1Mol/L pH2.4甘氨酸－HCl缓冲液，流速1ml/min，收集解吸附下来的成分，立即以1Mol/L NaHCO3中和，以免蛋白变性。5．以两倍体积的7Mol/L尿素洗涤，再用0.01Mol/L pH 7.4PB液或生理盐水洗涤，平衡后，可继续使用。保存可加入0.02%Na N3于4℃保存。防止冷冻和干裂。6．结果判定 ⑴ 对解吸附下来的蛋白以圆盘电泳或双相琼脂糖电泳进行纯度鉴定。⑵ 将纯度好的各管洗脱液合并，以生理盐水透析，然后浓缩或冻干保存。
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