凝胶层析技术

干粉的用量。表 Sephadex1的种类与特性型号分离范围（分子量）吸水量（ml/g）最小溶胀时（h） 20℃～25℃ 100℃ 床体积（ml）/干凝胶（mg） G10 ＜700 1.0±0.1 3 1 2~3 G15 ＜1 500 1.5±0.2 3 1 2.5~3.5 G25 ＜5 000 2.5±0.2 3 1 4~6 G50 1500～20 000 8.0±0.3 3 1 9~11 G75 3 000～70 000 7.5±0.5 24 1 12~15 G100 4 000～15 000 10.0±1.0 72 1 15~20 G150 5 000～800 000 15.0±1.5 72 1 20~30 G200 5 000～30 0000 20.0±2.0 72 1 30~40 G25、G50有四种颗粒型号：粗（100µ~300µ）、中（50µ~150µ）、细（20µ~80µ）和超细（10µ~40µ）。G75～G200又有两种颗粒型号：中（40µ～120µ），超细（10µ～40µ）。颗粒越细，流速越慢，分离效果越好。表　DEAE－纤维素与Sephadex1比较项目 DEAE纤维素 Sephadex 交换量小较大非特异性吸附较大小分离纯度较好好分离时间较粗较长应用范围较窄较宽预处理繁琐方便（三）试验方法1．凝胶的选择根据层析物质分子量的大小选择不同型号的凝胶，如除盐和除游离的荧光素，则可选用粗、中粒度的G28或G500，G250多用于分离蛋白质单体，G200多用于分离蛋白质凝胶聚合体等。2．凝胶的预处理称取适量的凝胶加入过量的缓冲液在冰箱（或室温）中充分膨胀，或在沸水中煮，膨胀时间应根据不同型号的凝胶而定。表　凝胶量与型号和层析柱大小与规格及凝胶用量层析柱规格凝胶的规格和用量（g）直径（cm）高（cm）容量（ml） G25 G50 G100 G200 0.9 15 9.5 2.5 1 0.6 0.3 0.9 30 19 5 2 1.2 0.6 0.9 60 38 10 4 2.5 1.2 1.6 20 40 10 4 2.5 1.2 1.6 40 80 20 8 5.0 2.4 1.6 70 140 35 14 9.0 4.4 1.6 100 200 50 20 12.5 6 2.6 40 210 50 20 12 7 2.6 70 370 90 35 20 12 2.6 2.6 100 60 530 1 000 130 250 50 110 30 70 17 35 为使粒子均匀一致需进行浮选，即加入凝胶粒子后，轻轻搅拌，静置20min，倾去沉淀的粒子，如此反复数次即可。3．装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时，柱床体积应为样品体积的25～100倍。去盐、游离荧光素约为样品体积的4～10倍。柱太短，影响分离效果。柱长一些，分离效果好，但柱太长，则延长分离时间，样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细，会发生“器壁效应”，即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为1︰5～1︰25；对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。装柱过程基本同离子交换层析柱。4．加样与洗脱样品体积不宜过多，最好为床体积的1％～5%，最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大，浓度过大粘度大，分离效果差，一般不超过4%。洗脱液应与膨胀一致，否则更换溶剂，凝胶体积会发生变化，影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.02～0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液（0.14Mol/L NaCl）和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液（0.14Mol/L NaCl）。5．洗脱液收集同离子交换层析。6．凝胶柱的重复使用与保存当样品的各组分全部洗脱下来之后，即可加入新的样品，继续使用。保存方法有三种：⑴ 在液相中保存最方便，即于凝胶悬液中加入防腐剂（一般为0.02%N2N3或0.002%洗必泰）或高压灭菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。⑵ 用完后，以水冲洗，然后用60%~70%酒精液冲洗，凝胶体积缩小，即在半收缩状态下保存。⑶ 长期不用者，最好以干燥状态保存，即水洗净后，用含乙醇的水洗，逐渐加大乙醇用量，最后用95%的乙醇洗，可全部去水，再用乙烯去除乙醇，抽滤干，于60℃~80℃干燥后保存。
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