层析技术(Layer-analise technique)

高于等电点时，蛋白质被阴离子交换剂所吸附；当溶液的pH值低于等电点时，蛋白质被阳离子交换剂所吸附。由于各种蛋白质所带的电荷不同。它们与交换剂的结合程度也不同，只要溶液pH值发生改变，就会直接影响到蛋白质与交换剂的吸附，从而可能把不同的蛋白质逐个分离开来。交换剂对胶体离子（如蛋白质）和无机盐离子（如NaCl）都具有交换吸附的能力，当两者同时存在于一个层析过程中，则产生竞争性的交换吸附。当Cl一的浓度大时，蛋白质不容易被吸附，吸附后也易于被洗脱，当Cl一浓度小时，蛋白质易被吸附，吸附后也不容易被洗脱。因此，在离子交换层析中，一般采用两种方法达到分离蛋白质的目的。一种是增加洗脱液的离子强度，一种是改变洗脱液的pH值。pH值增高时，抑制蛋白质阳离子化，随之对阳离子交换剂的吸附力减弱。pH值降低时，抑制蛋白质阴离子化，随之降低了蛋白质对阴离子交换剂的吸附。当使用阴离子交换剂时，增加盐离子，则降低pH值。当使用阳离子交换剂时，增加盐离子浓度，则升高溶液pH值。（二）常用离子交换剂的种类与特性 1.离子交换纤维素离子交换纤维素的种类很多，其种类与特性如表1－1所示。表1-1 离子交换剂的类型与特点交换剂名称（纤维素）作用基团特点阴离子交换剂二乙氨基乙基 DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H 最常用在pH8.6以下三乙氨基乙基 DEAE+-O-C2H4N+(C2H5)2H 氨乙基 AE+-O-C2 H4-N H2 胍乙基强碱性、极高pH仍有效阳离子交换剂羧甲基 CM—-O-CH2-COO— 最常用在pH4以上磷酸 P－-O- P O2－用于低pH 磺甲基 SM－-O-CH2-SO3－磺乙基 SE－-O-C2H4-SO3－强酸性用于极低pH 在交换纤维素中，最常用的是DEAE—纤维素和CM纤维素。由于剂型不同，其理化性质和作用也有所差异。一般而言，微粒型要优于纤维素型，因为微粒型是在纤维素型的基础上进一步提炼而成。它的交换容量大，粒细、比重大，能装成紧密的层析柱，要求分辨力高的实验可用此型纤维素（见表1－2）。表1-2 商品DEAE—纤维素和C M纤维素的类型和特性纤维素形状长度交换当量（毫克当量/克）蛋白质吸附容量（mg /g牛血清白蛋白）床体积（ml / g） pH 6.0 pH 7.6 DE-22 改良纤维 12~400 1.0±0.1 450 7.7 7.7 DE-23 改良纤维（除细粒） 18~400 450 8.3 9.1 DE-32 微粒型（干） 24~63 660 6.0 6.7 DE-52 微粒型（湿） 24~63 660 6.0 6.3 DE-11 旧型号 50~250 130 与以上相应型号同溶菌酶pH5 CM-22 0.6±0.06 600 7.7 7.7 CM-23 600 9.1 9.1 CM-32 1 260 6.8 6.7 CM-52 1.0±0.1 1 260 6.8 6.7 离子交换纤维素的优点为：①离子交换纤维素为开放性长链，具有较大的表面积，吸附容量最大；②离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱；③具有良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广。2．离子交换交联葡聚糖离子交换交联葡聚糖也是广泛使用的离子交换剂，它与离子交换纤维素不同点是载体不同，常用交联葡聚糖的类型与特性见表1-3。表1-3 常用交联葡聚糖的类型与特性类型性能离子基因反离子总交换容量（毫克当量/g） DEAE-sephadexA-25 弱碱性、阴离子交换剂 DEAE+ Cl— 3.5±0.5 DEAE-sephadexA-50 QAE-sephadex-25 弱碱性、阴离子交换剂 QAE+ Cl— 3.0±0.4 QAE-sephadex A-50 CM-A- sephadex 25 弱碱性、阳离子交换剂 CM— Na+ 4.5±0.5 CM- sephadex A-50 SP- sephadex A-25 强碱性、阳离子交换剂 SP— Na+ 2.3±0.3 SP- sephadex A-50 离子交换交联葡聚糖有如下优点：①不会引起被分离物质的变性或失活；②非特异性吸附少；③交换容量大。离子交换葡聚糖的选用，一般根据蛋白质的分子量而定。中等分子量（30 000-200 000）一般选A50和C50，而低分子量（＜30 000和高分子量＞200 000）均宜选用A25和C25。（三）试验方法阴离子交换剂与阳离子交换剂的装柱和层析过程基本相同。交联葡聚糖的预处理只需充分溶胀和平衡，不需要除去细粒碎片和酸碱处理。其他步骤也基本同离子交换纤维素。1．剂型的选择根据蛋白质在所用缓冲液pH值下带电荷的种类选择，如pH高于蛋白质等电点，应选阴离子交换剂，反之应选阳离子交换剂。一般情况下，DEAE-纤维素用于分离酸性蛋白，而CM纤维素用于分离碱性蛋白质。下面以DEAE-纤维素操作为例，介绍试验方法2．膨胀活化此步的目的在于除去杂质，暴露DEAE-纤维素上的极性基团。DEAE-纤维素的用量则根据柱容积的大小和所需过柱样品的量来决定。一般是1.0g DEAE-纤维素相当于6ml～8ml柱床体积。表1－4 分离的血清与所需DEAE—纤维素量及其他条件的大致关系血清样品量（ml） DEAE需用量（g）选层析柱规格（cm）选脱液量（ml） 1~2 2 1×25 100~150 5 5 2×12 200~300 10 10 2×20 300~400 20 20 2×37 400~800 称取所需的量，撒于0.5Mol/L NaOH溶液中（1g DEAE—纤维素干粉约需15倍NaOH液），浸泡1h左右，不时搅拌。抽滤（以布氏漏斗加两层滤纸或尼龙纱布抽滤），以蒸馏水洗涤，再抽滤，直至滤液近中性为止，再将纤维素浸泡于0.5Mol/L HCl中1h，同样抽滤液至近中性。再将纤维素浸于0.5Mol/L NaOH液中，同样处理，洗至中性。3．平衡将DEAE—纤维素放入0.0lMol/L pH 7. 4 PB液中（即起始缓冲液），静止1h，不时搅拌，待纤维素下沉后，倾去上清液或抽滤除去洗液，如此反复几次至倾出液体的pH值与加入的PB液的pH值相近时为止。4．装柱层析柱的选择要大小、长度适当。一般而言，柱长和柱直径之比为10︰1～20︰1，柱的内径上下要均匀一致。用前将层析柱在清洁液内浸泡处理24h，然后依次用常水、蒸馏水、起始缓冲液充分洗涤。装柱时，先剪一块圆形的尼龙纱布（直径与层析柱内径一致），放入层析柱底部。将柱下端连接细塑料管，夹上螺旋夹。把层析柱垂直固定在三角铁架上，倒入起始缓冲液至一半的柱高，除去死区及塑料管内的气泡。再将平衡的DEAE－纤维素糊状物沿管壁倒入柱中。注意不要产生气泡，如有气泡应排除或重装。拧开螺旋夹，使流速至1ml/5min，待缓冲液快接近纤维素面时，继续倒入纤维素糊，同时用玻璃棒搅拌表面层，以免使两次加入的纤维素形成分界层，通过进出缓冲液调节流量，也可通过塑料管的升降来控制，至柱床体积不变为止。剪一圆形滤纸（与柱内径大小一致），从柱的上端轻轻放入，使其沉接于纤维素床表面，以免在加样时打乱纤维素层。装好柱的柱面应该是平整的，无倾斜，整个柱床内无气泡、不分层。继续平衡，使流出液的pH值与流入液的pH值完全一致为止。5．上样要层析的样品首先必须用起始缓冲液（4℃）平衡过夜，中间可换液数次。将柱的上端打开，用吸管将纤维素柱上面的缓冲液吸出，不要吸净，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入样品，注意不要打乱纤维素表层。拧开下端的螺旋夹，使样品进入交换剂中，快要进完时，加1ml～2ml缓冲液冲洗柱壁，随即用多量的洗脱液洗脱。样品的加量与DEAE—纤维素有一个最适比的关系，超过这个比值，吸附就不完全，直接影响到分离的纯度。经过粗提的 —球蛋白50mg～100mg，用干重约4g DEAE－纤维素装柱分离，可获得理想结果。6．洗脱对于阴离子交换剂而言，洗脱的办法是使pH逐渐降低，而离子浓度逐渐升高。一般的办法，是稳定一个因素而改变另一个因素洗脱。洗脱可采用分段洗脱和连续洗脱法，前者较实用，后者较准确。表1－5 血清蛋白各成分的吸附与解吸的关系成分等电点 DEAE吸附能力解吸顺序白蛋白 4.9 5.6 5.1 7.3 强弱后先表1－6 血清的分段洗脱成分 NaCl浓度（Mol/L） 0.01Mol/L PB（pH）洗脱部分 0.025 8.0 IgG 0.030 7.0 IgG 0.040 7.0 运铁蛋白、纤维蛋白原 0.060 6.5 白蛋白、IgA 0.150 6.5 IgM 白蛋白表1－7 各种Ig解脱吸附条件不加NaCl PB离子强度（Mol/L） pH Ig 其他 0.01 8.0 IgG 0.025 8.0 IgE 0.035 7.0 IgA 0.040 5.9 球蛋白 0.10 5.8 白蛋白 0.40 5.2~4.5 IgM 球蛋白 7．洗脱液的收集利用自动分步收集器收集，并以20%磺基水杨酸测试，当蛋白液下来时，开始分管收集，至无蛋白液为止。8．交换柱的再生将使用过的DEAE－纤维素移入烧杯中，用2Mol/L NaCl液浸泡，抽滤并洗涤数次。如不立即使用，可加1/10 000的叠氮钠防腐，保存于4℃冰箱中。使用时，再以碱－酸－碱处理。
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