甲醇酵母表达系统

D-丙氨酸羧肽酶 0.8 ［5］ α-淀粉酶 2.5 ［6］ Kunitz蛋白酶抑制剂(AbPP) 1.0 ［7］瞬时抗凝蛋白(TAP) 1.7 ［8］破伤风毒素片段C 12.0 ［9］百日咳抗原P69 3.0 ［10］人免疫缺陷病毒1膜外糖蛋白gp120 1.3 ［11］肿瘤坏死因子(TNF) 10.0 ［12］人转铁蛋白N端 4.0 ［13］ 2. 实现外源蛋白质高效产生的关键因素2.1 表达载体首先，甲醇酵母中没有稳定的质粒，所以其表达载体采用整合型质粒。利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX1)的启动子(PAOX1)和转录终止子(3′AOX1)构建成整合型表达载体。PAOX1是一个极强的启动子，醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%［2］，所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。其次，在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体，一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷，另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。此外，使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体，形成多个表达单元，产生高产的菌株，此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。2.2 受体菌在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，诱导基因表达，使外源蛋白质的产量更高。甲醇酵母适合高密度连续培养的条件，细胞干重达100g/L以上，蛋白质产量极高［14］。受体菌采用蛋白水解酶缺陷型，从而大大降低产物的降解。常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。3. 应用前景经过近几年的发展完善，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入，它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。表2 国内利用甲醇酵母产生的外源蛋白质外源蛋白质产生量(g/L) 文献人胰岛素 0.25 ［15］人胰岛素原 0.3 ［16］人p53蛋白 0.2 ［17］辣根过氧化物酶 4～6 ［18］人基质金属蛋白酶-9 0.01 ［19］参考文献［1］李黄金等. 《生物工程学报》，1998，14(4)：337［2］戴秀玉. 《微生物学报》，1997，37(6)：483--485［3］彭毅等. 《生物技术通报》，2000，(1)：38［4］Tschopp JF. Bio/Technology，1987，5：1305-1308［5］Despreaux CW et al. Gene，1993，131：35--41［6］Paifer E et al. Yeast，1994，10：1415--1419［7］Wagner SL et al. Biochem Biophys Res Commun，1992，186：1138--1145［8］Laroche Y et al. Bio/Technology，1994，12：1119--1124［9］Clare JJ et al. Bio/Technology，1991，9：455--460［10］Romanos MA et al. Vaccine，1991，9：901--906［11］Scorer CA et al. Gene，1993，136：111--119［12］Sreekrishna K et al. Biochemistry，1989，28：4117--4125［13］Cregg JM et al. Bio/Technology，1993，11：905--910［14］柴清等.《生命的化学》，1997，17(4)：36［15］王燕等.《生物化学与生物物理学报》，1999，15(3)：587--589［16］郭永志等.《生物工程进展》，1999，19(6)：64［17］邱荣德等.《生物工程学报》，1999，15(4)：477［18］蒋太交等.《生物化学与生物物理进展》，1999，26(6)：584［19］颜红春等.《中国生物化学与分子生物学学报》，2000，16(2)：194
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