DNA重组实验中常用的技术

一、质粒DNA的提取及鉴定　　（一）质粒DNA的提取及鉴定　　1．收获细菌　　（1）将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到通气良好的15ml的试管中，接入一单菌落，于37℃剧烈振荡培养过夜。　　（2）将1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，用台式离心机于4℃以12000g离心5min，将剩余的培养物贮存于4℃。　　（3）吸尽培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。　　2．碱裂解法小量抽提质粒　　（1）将细菌沉淀[上述步骤（3）所得]重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ（50mmol/L葡萄糖，25mmol/l Tris –HCl pH8.0, 10mmol/L EDTA）中，剧烈振荡。　　（2）加200μl新配制的溶液Ⅱ（0.2mol/l NaOH, 1%SDS），缓和振荡，水浴5min。　　（3）加150μl预冷溶液Ⅲ（50mol/L KAC 60ml, 冰乙酸11.5ml,水28.5ml），缓和振荡，冰浴5min。　　（4）4℃以12000g离心5min，将上清转移到另一离心管中。　　（5）可作不可作：加等量饱和酚，氯仿，振荡混匀，重复2，（4）。　　（6）用2倍体积无水乙醇室温沉淀双链DNA，振荡混合，于室温放置2min。　　（7）4℃以12000g离心5min。　　（8）小心吸尽上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，再将附于管壁的液滴除尽。　　（9）
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