分子生物学试验方法探讨一－Northern blots 技术

结合物热稳定性很高，RNA探针杂交要求更高的杂交温度(68度)和更严谨的洗膜条件，使背景降低；且合成RNA探针的DNA模版可以经DNase消化处理，不会干扰杂交，这些因素使得选用RNA探针比DNA探针的灵敏度提高10倍以上。同样理由，单链DNA探针又比Random Primed的双链探针要好。膜的选择由于硝酸纤维素膜通常不能耐受2轮以上的杂交和洗膜操作，而带正电的尼龙膜对RNA的结合力强且能从容耐受多轮杂交而信号并不减弱，处理大张膜时又不必担心撕裂或卷曲，因而成为首选。带正电的尼龙膜的唯一缺点是背景较高，特别是使用RNA探针时。样品的选择由于膜的载量有限，Northern blots的上样量因而受限，提高分辨率的方法之一是用mRNA代替总RNA电泳以提高mRNA的总量，而选用带更高电荷的尼龙膜得到更大的结合容量也有类似的作用。转移方法转移的方法有多种，真空转移因为快速高效而成为首选。没有条件做真空转移的可以选择毛细管转移或电转移。传统方法为上行毛细管转移，即吸水纸在胶、膜的上方，需4-18小时。Ambion公司推出的NorthernMax Kir提供了一种下行毛细管转移法，即吸水纸在胶、膜的下方，配合它的转移缓冲液可加快RNA，特别是大分子RNA的转移，使RNA转移得更完全，分辨率提高，且转移过程可缩短至１小时。由于将核酸通过电转移到硝酸纤维素膜上要求很高的离子浓度，导致电流太大，需要大体积的缓冲液以保证缓冲容量不因电解而耗尽和大体积的冷却系统，因而这一方法较少使用。而核酸能在低离子强度下电转移固定在尼龙膜上，这也是尼龙膜优于硝酸纤维素膜的另一原因。杂交液的选择杂交液的选择直接影响信噪比、非特异性背景的高低。杂交液中应含有与探针匹配的阻断剂。许多杂交液只含有DNA阻断剂，当要做RNA探针杂交时必须加入变性的酵母总RNA或其它RNA阻断剂。另外杂交液应经过严格过滤以除去可能引致斑点背景的不溶物和小颗粒。当然它必须是无DNAse及RNAse的。甲醛vs.乙二醛？在含有甲醛的变性胶中进行RNA电泳是较常见的方法。相比之下，乙二醛／DMSO方法无须制备甲醛变性琼脂糖凝胶，无须通风橱等安全设备，只需将样品用乙二醛／DMSO预处理变性，在普通胶上电泳即可。但由于泳动速度慢而往往需要将电泳液循环以避免形成过高的氢离子梯度。
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