λ噬菌体DNA提取

g，加ddH2O 至100ml，0.22μm滤膜过滤。4. SM液：NaCl 5.8g，MgSO4·7H2O 2g，1M Tris·CL（PH7.5）50ml，2%明胶 5ml，加ddH2O 至1000ml。15lbf/in2高压灭菌20min。5. RNase A 10mg/ml，TE配制，沸水浴15min，分装后贮存于-20℃。6．DNase I 10mg/ml，TE配制，分装后贮存于-20℃。 7. PEG 80008. 10%SDS9．EDTA: 0.5M pH8.03.苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）4.异丙醇5.无水乙醇、70%乙醇二、操作步骤1.λ噬菌体平板培养⑴ 用SM液10倍梯度稀释λ噬菌体原种。⑵ 取0.1ml各梯度稀释离心到一消毒微量离心管中，加0.2ml新鲜培养的宿主菌，加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mm），37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。⑶ 取熔化（47℃）0.7%琼脂LB固体培养基3ml与上述管混匀，立即倒入预备（2-4天）的含凝固1.5%琼脂LB固体培养基的平板内，轻轻晃动平板使均匀分布。⑷ 37℃培养6-8hr后，观察噬斑形成。⑸ 用剪去部分头部的吸头挖取单个噬斑到0.5ml的SM液中，加0.05ml氯仿，震荡。37℃温育10min。⑹ 重复⑴-⑷，获得单个噬斑滴度。2. λ噬菌体液体培养⑴ 取2ml新鲜培养的宿主菌，离心，0.4ml LB培养基重悬，加λ噬菌体0.1ml（新鲜获得的单个噬斑，依滴度使之与宿主菌比约1/500-1000）。⑵ 加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃温育20min，使噬菌体颗粒吸附于细菌。⑶ 加到100ml LB液体培养基中，加麦芽糖（0.2%），MgSO4（10mM），37℃摇震培养9-12hr后可见裂解发生。⑷ 加0.1ml氯仿，37℃继续摇震培养10-20min。（二）λ噬菌体DNA提取1.将上述裂解液转移至离心管，离心8000g×10min，去细菌碎片，取上清液。2.加RNase A、DNaseI 至1μg/ml， 37℃温育30min。3.加9.3g PEG 8000，5.8g NaCl，摇匀至溶解，冰浴1hr或4℃过夜。4.4℃离心10000g×20min，去上清液。5.加2ml SM液，充分洗溶管壁及沉淀，移到新微量离心管，加20μl 10%SDS，20μl 0.5M EDTA，68℃15min。6.加等体积苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），混匀，离心12000g×5min，取上层液到一新微量离心管，加等体积氯仿/异戊醇（24：1），混匀，离心12000g×5min。7.取上层液到一新微量离心管，加等体积异丙醇，混匀，-20℃1hr，4℃离心12000g×10min，去上清液。8.1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，4℃离心8000g×7min，弃上清，将沉淀室温下晾干。9.沉淀溶于20μl TE，-20℃保存备用。三、注意事项1.用于裂解的噬菌体、宿主菌为新鲜培养获得时，裂解好、裂解噬菌体收获量大。2.液体培养裂解时，如到培养时间时裂解尚未发生，可适当提高培养温度或加大摇震速度。3.RNase A 、DnaseI消化不全，DNA、RNA可粘走部分噬菌体。4.苯酚/氯仿抽提时，注意PEG、蛋白质等杂质污染，它们会影响限制性内切酶切割。
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