F．将剩下的3张滤纸小心的放在转移膜的上面，并放一叠吸水纸搭在滤纸上，再放一玻璃板，其上压一重物。G．转移几小时或过夜(至少4小时)注意：勿使转移液干枯。7)已转移的DNA与膜交联A．将膜放在浸有10 X SSC的厚滤纸上，有DNA的一面朝上。B．将膜置于UV crosslinker 中，在紫外光下自动交联。C．用蒸馏水短暂的漂洗已交联的膜，空气中干燥。此膜可在4oC长期保存。8)DNA探针的制备(略过)参照生产商提供的实验方法合成地高辛标记的探针。9）印迹的预杂交将适量的预杂交液DIG Easy Hyb在42 oC预热。放入印迹膜,在42 oC预杂交30min。10)准备探针水煮地高辛标记的探针5min使变性, 并立即放在冰上2min.11) 加适量的探针到已预热的杂交液中,混合均匀(避免形成泡沫,影响杂交效果)。42 oC杂交至少4小时或过夜。注意: 不要将探针直接加在印迹膜上，而应加在容器一角的预杂交液中12）印迹膜的冲洗：A．将杂交液倒出，储存起来可再次使用。B． 用25mL的2 X SSC,0.1% SDS 在室温摇动洗膜2次,每次5min .C． 用已预热的30mL 0.5XSSC,0.1%SDS 在65 oC摇动洗膜2次,每次15min (用杂交炉).13)免疫检测:A. 用10mL冲洗液洗膜1-5min.B. 膜在15mL阻断液中孵育30min C. 膜和8mL抗体孵育30minD. 在15mL冲洗液中洗膜2次,每次15min.E. 在15mL检测液中平衡2-5min. 14)将膜的有DNA的面朝上,放在保鲜纸上,滴数滴CSPD ready-to-use 覆盖膜; 然后,立即用保鲜纸包裹, 挤掉多余的CSPD ready-to-use,使其均匀平铺在膜上,没有气泡, 但避 免使膜干掉. 室温孵育5min.15)在37 oC孵育潮湿的膜10min,增强发光.16)用X-光底片将杂交膜进行曝光10-25min.(发光性能至少可持续48小时)17) X-光底片的冲洗Agfa 30显影液显影(1-5min)---冲水(1min)---F5定影液定影(10min)---用水冲洗---晾干底片
< 1 > < 2 >
|
