测序技术

技术一、概述：　　Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。　　Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。　　退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。　　由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03--2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。　　二、材料待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。　　三、设备高压电泳仪，测序用电泳槽，制胶设备，PCR仪。　　四、试剂　　（1）SILVER SEQUENCETM DNA测序试剂盒。　　（2）丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺储备液（38%丙烯酰胺 W/V，2%甲叉双丙烯酰胺 W/V)：95g丙烯酰胺，5g甲叉双丙烯酰胺溶于140ml 双蒸水中，定容至250ml，0.45mm过滤器过滤后，贮于棕色瓶中，置于4℃冰箱可保存2周。　　（3）10%过硫酸铵，0.5g过硫酸铵溶于4ml水中，定容至5ml，应新配新用。　　（4）10×TBE缓冲液（1 mol/L Tris, 0.83mol/L 硼酸，10mmol/L EDTA)： 121.1g Tris，51.35g硼酸，3.72g Na2 EDTA ·2H2O，溶于双蒸水中定容至1升，置于4℃下可贮存2周，其pH约为8.3。　　（5）TBE电极缓冲液：10×TBE 缓冲液稀释至1×TBE备用。　　（6）TEMED 　　（7）固定/停止溶液：10%冰醋酸（V/V）配制2升备用。　　（8）染色溶液：硝酸银2克，甲醛3ml，溶于2升超纯水中备用。　　（9）显影溶液：60克碳酸钠（Na2CO3)溶于2升超纯水中，使用前加3ml 37% 甲醛和 40ml硫代硫酸钠溶液（10mg/ml)。　　（10）95%乙醇。　　（11）0.5%冰乙酸。　　（12）Sigmacote (Sigma CAT. #SL-2)。　　五、操作步骤：　　成功地使用银染测序系统需要对提供的操作方法进行仔细考虑。银染不如放射性检测法灵敏，而需要更多的模板量，此外，也不可能通过延长X-光胶片曝光时间的方法增加信号强度。因此，请使用推荐的DNA模板量, 每次均使用所提供的对照检查系统的可靠性，并且注意如下几点：　　　　（1） DNA的浓度和纯度必须经过琼脂糖凝胶电泳或荧光法测定, 样品应与已知量DNA一起电泳。　　　　（2）分光光度法对于很多DNA提取物包括质粒小量制备来说，并不能给出一个可信的DNA浓度估计，混杂的染色体DNA、蛋白、RNA、有机物及无机化合物均可能有260 nm光吸收。因此，分光光度法常常错误地高估DNA浓度。　　　　（3） DNA制备过程中用核糖核酸酶处理所产生核糖核苷酸，虽然它们在电泳后DNA样品的前面，并不能观察到，但它们仍会有260nm光吸收。　　（一）测序反应：　　　　　1. 对于每组测序反应，标记四个0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml适当的d/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(约20ml)矿物油，盖上盖子保存于冰上或4℃备用。　　　　2. 对于每组四个测序反应,在一个eppendorf管中混合以下试剂：　　　　（1）样品反应：　　　　　　质粒模板DNA 2.1pmol 　　　　　　5×测序缓冲液 5ml 　　　　　　引物 4.5pmol 　　　　　　无菌ddH2O 至终体积16ml 　　　　（2）对照反应　　　　pGEM-3Zf(+)对照DNA(4mg)　　 4.0ml 　　　　　　5×测序缓冲液 5ml 　　　　　　pUC/M13正向引物(4.5pmol) 3.6ml 　　　　　　无菌ddH2 O 至终体积 16 ml 　　3. 在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml测序级Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸动几次混匀。　　4. 从第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一个d/ddNTP混合物的管内。　　5. 在微量离心机中离心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。　　6. 把反应管放入预热至95℃的热循环仪，以[注意]中循环模式为基准，开始循环程序。对于每个引物/模板组合都必须选择最佳退火温度。下列程序一般能读出从引物开始350碱基的长度。　　7. 热循环程序完成后，在每个小管内加入3μl DNA测序终止溶液，在微量离心机中略一旋转，终止反应。　　[注意] 1、测序所用模板DNA的量一般按下面要求加入：模板种类/长度模板量 200bp (PCR产物) 16ng(120fmol) 3000-5000bp（超螺旋质粒DNA) 4mg (2pmol) 48000bp(λ,粘粒DNA) 1mg(31fmol) 　　由于超螺旋质粒产生的信号比松驰的线性双链DNA弱，因此使用超螺旋质粒作为模板时其用量要比其它模板大一些。　　　　2、计算与4.5pmol相当的引物纳克数可用以下一般公式：　　　　4.5pmol=1.5ng×n,其中n为引物碱基数　　　　计算与1pmol相当的引物微克数可用以下一般公式：　　　　dsDNA:1pmol=(6.6×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基对数　　　　ssDNA:1pmol=(3.3×10-4 mg)×n,其中n为模板碱基数　　3、为阻止Taq DNA聚合酶延伸非特异性退火引物，热循环仪必须预热至95℃。温度变换应越快越好。下面的循环时间不包括变温时间。如果你无法确定使用何种模式，建议从模式1开始。　　　　模式1：适用于引物<24碱基或GC含量<50% 　　95℃ 2分钟。然后： 95℃ 30秒(变性), 42℃ 30秒(退火), 70℃ 1分钟(延伸)。　　　　模式2:适用于≥24碱基或略短的GC含量≥50%的引物。　　95℃ 2分钟, 然后: 95℃ 30秒(变性), 70℃ 30秒(退火/延伸)。 4. 在加入终止溶液之后样品可在4℃保存过夜。共3页: 上一页 1 [2] [3] 下一页
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