图谱是RFLP研究的主要目标之一。 运用随机引物扩增寻找多态性DN-段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplified polymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10聚体)为引物,对所研究基因组DNA进行PCR扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DN-段的多态性,这些扩增产物DN-段的多态性反映了基因组相应区域的DNA多态性。RAPD所用的一系列引物DNA序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DN-段.因此如果基因组在这些区域发生DN-段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR产物检测即可检出基因组DNA的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD可以对整个基因组DNA进行多态性检测。另外，RAPD片段克隆后可作为RFLP的分子标记进行作图分析。 本实验将学习RFLP的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。 第二节 RFLP技术 一、 材料 基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。 二、设备 电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸 ，eppendorf管(0.5ml)若干。 三、试剂： 1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。 2、5×TBE电泳缓冲液：配方见第一章。 3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。 4、中和液：1mol/LTris·Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。 5、10×SSC：配方见第九章。 6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris·Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%， 0.25mol/L HCl 。 四. 操作步骤 1. 基因组DNA的酶解 (1) 大片断DNA的提取详见基因组DNA提取实验,要求提取的DNA分子量大于50kb, 没有降解。 (2) 在50μl反应体系中,进行酶切反应: 5μg基因组DNA 5μl 10×酶切缓冲液 20单位（U）限制酶(任意一种) 加ddH2 O, 至50μl (3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。 (4) 取5μl反应液,0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb的明显亮带出现。 [注意] 未酶切的DNA要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。 2. Southern转移 （1） 酶解的DNA经0.8％琼脂糖凝胶电泳(可18V过夜)后EB染色观察。 （2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl中脱嘌呤, 10分钟。 （3） 取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30分钟。 （4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC盐溶液吸印,维持18-24小时。也可用电转移或真空转移。 （5） 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30秒, 迅速转至0.2mol/L Tris·Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。 （6） 将膜夹于2层滤纸内, 80℃真空干燥2小时。 （7） 探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。 [注意] 1、 步骤（2）中脱嘌呤时间不能过长。 2、 除步骤（1）、（4）、（5）外, 其余均在摇床上进行操作。 3、步骤（4）中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。 4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP的差异，这时应该试用另一种酶。 第三节 RAPD技术 一、 材料 不同来源的DNA(50ng/ul)。 二、设备 PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。 三、试剂 1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。 2、Taq酶：购买成品。 3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。 4、MgCl2 ：25mmol/L。 5、dNTP：每种2.5mmol/L。 四、操作步骤： 1. 在25ul反应体系中,加入 模板DNA 1ul (50ng) 随机引物 1ul (约5pmol) 10xPCR Buffer 2.5ul MgCl2 2ul dNTP 2ul Taq酶 1单位（U） 加ddH2O 至 25ul 混匀稍离心, 加一滴矿物油。 2. 在加热至90℃以上的PCR仪中预变性94℃ 2分钟, 然后循环: 94℃ 1分钟， 36℃ 1分钟， 72℃ 1分钟，共40轮循环。 3. 循环结束后, 72℃ 10分钟，4℃保存。 4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。 5. 电泳结束，观察、拍照。 [注意] 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。 2、 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。 思考题 1. DNA酶切反应不彻底会有何结果? DNA发生降解有何影响？ 2. Southern转移中脱嘌呤时间为何不能太长？ 3. 随机引物扩增,为什么会产生DNA双链产物?
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