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的μMACS mRNA Isolation Kit为例,在纯化对照(driver)mRNA时先将组织裂解,加入耦联了Oligo dT的磁珠悬液,混匀并立即加入放在磁场中的磁式分离柱中,磁珠上的Oligo dT有效吸附mRNA并悬浮在磁场中,其它杂质随溶液流出。加入新鲜的wash buffer反复淋洗干净挂上mRNA的磁珠后,不用洗脱液洗脱mRNA,而是利用磁珠上的Oligo dT作为RT引物直接进行反转录反应,再用Elution buffer洗脱mRNA,得到耦联在磁珠上的对照单链cDNA库。这时将样品(tester)的mRNA加入磁珠中,共同表达的基因对应的mRNA被磁珠上的cDNA吸附留在磁场中而特异表达的mRNA不被吸附随溶液流出柱外,这部分溶液反复过柱后得到的就是差异表达的mRNA。其它的mRNA分离试剂也可有类似的用法,只是本文介绍的方法由于得到的mRNA纯度高、完整且浓度高体积小,又是层析柱式的逐级淋洗使cDNA与mRNA吸附得更充分,所以假阳性较少。 这种方法得到的是全长的mRNA,可以直接得到全长的cDNA而无需拼接DN-断,且操作也较为简单。至于效率或假阳性率则因人而异了。 你还没注册?或者没有登录?
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