转基因动物的研究展望<%=id%>

    转基因动物（transgenic animal）技术是通过遗传工程的手段对动物基因组的结构或组成进行人为的修饰或改造，并通过相应的动物育种技术使得这些经修饰改造后的基因组在世代间得以传递和表现。利用这一技术，人们可以在动物基因组的特定位点引入所设计的基因突变，模拟造*类遗传性疾病的基因结构或数量异常；可以通过对基因结构进行修饰，在动物发生、发育的全过程研究体内基因的功能及其结构/功能的关系；可以在动物基因组引入病毒基因组以模拟病毒性疾病的发病过程；可以通过引入具有重要药用价值蛋白的编码基因，使动物成为该药物蛋白的生产农场；可以将所引入的DN*段作为环境诱变剂作用的靶DNA，通过对它回收后的结构分析，研究诱变剂造成DNA损伤和诱发基因突变的规律。转基因动物技术不仅在生命科学研究中的应用越来越广，技术本身的发展也越来越快，朝着修饰和精确性与可调性日益逼近。
    转基因动物技术体系的组成
    可以将转基因动物研究的整个系统归纳为三个部分。
    （1）上游部分：克隆目的基因，分析基因的结构并在体外或其他系统中进行功能研究。
    （2）中游部分：设计遗传修饰策略（包括载体系统的构建等），选择适当的靶细胞进行基因转移和鉴定，在此基础上将遗传修饰由细胞向整体动物过渡，实现对整体动物基因组进行人为修饰的目的。
    （3）下游部分；按育种程序进行工程动物的选育和建系，在整体动物的背景上对目的基因的功能进行详细的研究，并进一步地开发利用符合设计要求的遗传工程动物。
    其中“上游部分”是基础，根据相关的基顾研究为后续转基因动物研究提出需解决的问题；“中游部分”是技术的关键，也是整个技术体系的核心；而“下游部分”则是目的。近年来以“基因组计划”为代表的遗传学研究在认识基因组的结构组成方面正在大步地向前迈进，为通过转基因动物技术对动物基因组进行修饰提供了坚实、丰富的基础。
    转基因动物遗传修饰的策略及其发展
    从理论上讲，遗传工程的发展，已有可能运用多种策略在体外培育的哺乳动物细胞中对任何一个或几个已知基因组结构和DNA序列的位点进行各种类型的遗传修饰。
    导致产生新功能的基因组修饰
    （1）普通转基因：在基因组中转入一个能有效表达的基因，该基因可以是原基因组所没有的，也可以是有相应的内源基因的，还可以是结构发生了变化的内源基因等。
    （2）基因重复：指利用造成基因重复的基因打靶技术，在内源基因的邻近部位引入一个与内源基因含有相同调控序列的基因拷贝，而且原则上不破坏原基因邻近位点上的基因的结构。
    导致功能丢失的基因组修饰（loss of function）
    （1）插入突变：外源DN*段在基因组中发生整合后，势必造成插入位点的基因结构发生变化，如果该位点是某基因的所在位点，造成相应基因的结构破坏而导致的LOF，可以是在进行GOF的转基因时发生的，也可以是利用插入型载体进行的基因打靶。
    （2）大片段缺失突变：利用置换型的基因打靶载体，将内源基因的功能片段用某些选择基因片段替换而造成LOF的基因打靶方式。
    （3）引入点突变：通过基因打靶，可以对基因组中的特定的位点引入单个碱基置换或几个碱基的定向改变。
    （4）条件性基因缺失突变：利用位点特异性重组系统，如GreloxP，FLP/FRT系统，通过对造成体内基因打靶的重组酶表达的调控，在特定的组织或不同的发育阶段特异性地、或诱导性地害现所要求的遗传修饰事件，借以克服某些重要的基因在纯合缺失或杂合缺失状态下的致死效应和生存能力下降的问题。
    导致基因替换的基因组修饰
    基因替换：利用基因打靶技术进行的基因替换，使得替换位点上内源基因被另一个基因取代，使得内源基因丢失的同时，获得另外一个基因的功能，这种策略通常比较精确，不影响邻近位点基因的结构。
    染色体畸变
    利用位点特异性重组系统介导的DNA重组原理，通过对重组酶识别的位点在染色体上位置的控制以及重组酶表达的控制，可以造成各种类型的染色体畸变，如重复、倒位、相互易位等等。
    建立转基因动物途径及其发展
    能否将在细胞中进行的遗传修饰过渡到整体以及实现向后代的传递，主要取决于所进行修饰的细胞类型和与其相应的育种技术。至今为止，能够被有效地用来进行转基因动物研究的途径主要有以下几条：
    （1）受精卵原核显微注射和育种：以单细胞期受精卵为靶细胞，利用显微注射技术将构建时的载体DNA直接注射入受精卵的原核，并将受注射的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育，获得转基因动物个体。
    （2）胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES）介导的基因转移和育种；体外培养ES细胞，利用电穿孔等基因转移技术将载体DNA转入ES细胞后，在体外经过适当的筛选和鉴定，首选得到符合设计要求的基因组修饰，再将所获得的ES细胞经过囊胚腔注射等与受体囊胚细胞混合，并移植入假孕母体子宫继续发育产生嵌合体，通过利用生殖系嵌合子代设计适当的交配育种，获得纯系。
    （3）体细胞基因转移和克隆：以体外培养的哺乳动物体细胞为材料，通过普通的哺乳动物细胞基因转移技术，获得相应的经过遗传修饰的细胞后，直接利用核移植介导的哺乳动物体细胞克隆技术，即将该体细胞的细胞核移入去核的卵细胞中，并将所得细胞移入代孕动物，获得转基因动物克隆个体。
    （4）精子介导的基因转移和育种：将精子细胞（通常是灭能后，即细胞膜被破坏后）与转基因载体DNA混合共浴后，将精子头部直接注射入卵细胞，经过人工受精的受精卵移入假孕母体输卵管继续发育获得转基因动物个体。
    存在的主要问题及研究重点
    在克隆技术尚不可能推广应用的时候，针对转基因整合的随机性问题、ES细胞育种的效率低等问题，以及在我国切实建立向动物基因组引入点突变、引入基因重复突变、引入条件性突变等几种精确修饰基因组的策略，我们拟开展的工作主要包括4个方面：
    （1）通过提高ES细胞体外培养技术以及观察研究ES细胞体内分化规律及其影响因素，来提高ES细胞生殖系嵌合能力。我们试图通过建立高效表达报告基因（绿色荧光蛋白，GFP）的ES细胞株系和相应的示踪系统，并利用该ES细胞系来系统研究ES细胞在囊胚腔移植后的分化规律。我们构建了高效表达报告基因GFP的载体，以电穿孔的方式转入ES细胞，经筛选后得到阳性ES细胞移入小鼠的囊胚中，比较分析了ES细胞移入不同的胚胎发育期的实验结果。目前已获得了嵌合体小鼠，正在对移植ES细胞的分化规律进行分析。
    （2）基于hprt（hypoxanthineguanine phosphoribosyl transferase，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）基因位点的转基因定点整合系统的建立：针对受精卵原核显微注射法中转基因随机整合的缺点，我们曾提出建立“转基因定向整合系统”。结合基因DNA同源重组的基因打靶原理和位点特异性重组系统介导的重组和受精卵原核显微注射途径，来实现GOF的转基因定向整合。我们设计构建一套通用的将外源基因定向整合于小鼠hprt基因位点的工具载体，拟以与Alzehimer’s病有关的一种cdc2型激酶nck5a基因进行可行性和应用研究，可望得到一条可以用于GOF型转基因小鼠模型建立的通用系统。
    （3）向基因组中引入点突变的基因打靶研究：建立引入点突变基因打靶的技术体系，以精确地再现自然界的基因突变，具有重要的实用意义。我们以与血友病B发生有关的小鼠的凝血因子IX（mfix）基因突变为例进行普通knockout和用“in-and-out”策略在FIX基因组上特定的位点引入微小突变，以精确地模拟自然界的自友病B基因突变，在建立这一策略体系的同时，建立血友病B的模型。
    （4）诱导性突变和引入基因重复的基因打靶策略研究：该体系对组织特异性表达的基因功能及基因的数量性状的研究有重要的意义。我们已经进行了以脑内表达的nck5a基因为靶基因，构建基于位点特异性同源重组的nck5a基因的诱导型基因打靶和引入基因重复的基因打靶，研究神经细胞中蛋白（如tau）磷酸化与神经系统的发育、Alzhiemer病中神经纤丝的缠结等病理改变的发生。

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